เริ่มเข้ารับราชการในตำแหน่งหัวหน้าแผนกดิน กรมเกษตร กระทรวงเกษตร พ.ศ. 2482 - 2486 เลขาธิการมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ สำนักนายกรัฐมนตรี พ.ศ. 2487 - 2502 ดำรงตำแหน่งรองอธิการบดีมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ และในที่สุดไปเป็นปลัดทบวงมหาวิทยาลัยจนเกษียณ ตลอดจนมีงานพิเศษที่สำคัญคือ เป็นอนุกรรมการวางแผนผังการซ้อมใหญ่สำมะโนเกษตร, กรรมการพิจารณาเรื่องการลงทุน, กรรมการสภาวิจัยแห่งชาติ พ.ศ. 2502, กรรมการเกษตรวิจัย พ.ศ. 2503

ท่านได้เข้ามาทำงานที่มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ในปี พ.ศ. 2482 เมื่อครั้งที่หลวงสุวรรณวาจกกสิกิจดำรงตำแหน่งอธิการบดี และที่สำคัญอาจารย์เป็นผู้ที่ประพันธ์เนื้อร้องเพลงพระราชนิพนธ์ประจำมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ในปี พ.ศ. 2489 ในหลวงพระราชทานเพลงให้พระองค์เจ้าจักรพันธ์เพ็ญศิริ จักรพันธุ์ ดูแลเนื้อร้องหลายเพลง เช่น แสงเทียน ใกล้รุ่ง ต่อมาวันที่ 17 ธันวาคม พ.ศ. 2509 ในหลวงพระราชทานบทเพลงให้มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ซึ่งก่อนนั้นได้ พระราชทานให้จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ธรรมศาสตร์ ตอนนั้นพระองค์มีพระราชกระแสว่าให้ศาสตราจารย์ ดร.ประเสริฐ แต่งเนื้อเพลง ซึ่งเพลงประจำมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ที่ให้มา เป็นเพลงที่อ่อนหวาน และศาสตราจารย์ ดร.ประเสริฐ สามารถแต่งเสร็จภายในครึ่งคืน

ศาสตราจารย์ ดร.ประเสริฐ ท่านนึกถึงสัญลักษณ์มหาวิทยาลัย คือธงสีเขียว และในหลวงเคยตรัสว่า "เกษตรศาสตร์นี่สำคัญนะ เพราะการเกษตรจะต้องผลิตค้าส่งไปทั่วโลก" แล้วก็อยากให้นิสิตมีความสามัคคีรักใคร่กลมเกลียวกัน ขณะเดียวกันก็ใส่ความรู้สึกปลาบปลื้มที่ในหลวงพระราชทานให้ทุกอย่างรวมอยู่ในเพลงเพลงนี้ ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญในการประพันธ์เนื้อร้อง

นอกจากท่านจะมีความสามารถในการแต่งเพลงแล้ว พ.ศ. 2500 ได้สอนวิชาสถิติทุกคณะ วิชาสถิติเป็นพื้นฐานของปริญญาตรี เพราะฉะนั้นท่านต้องไปสอนที่จุฬาฯ ธรรมศาสตร์ เกษตร มหิดล ท่านเป็นผู้ริเริ่มหลักสูตรสถิติขึ้นในมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ และไปสอนในมหาวิทยาลัยศิลปากรในวิชาประวัติศาสตร์ ศิลาจารึกสุโขทัย ประวัติศาสตร์สุโขทัยภาษาถิ่น วรรณกรรม

ทั้งนี้เพราะท่านได้ค้นคว้าเกี่ยวกับนิราศหริภุญไชย เมื่อตอนอยู่ที่แม่โจ้แล้วก็ได้เขียนหนังสือ จึงทำให้ทุกคนรู้ว่าท่านเป็นคนที่สนใจภาษาไทย ต่อมาภายหลังท่านได้เปลี่ยนอาชีพไปอยู่ในทางศิลปศาสตร์มากกว่าอยู่ทางวิทยาศาสตร์

ในส่วนงานของมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ นอกจากเป็นเลขาธิการ รองอธิการบดีแล้ว ท่านยังเป็นผู้สนับสนุนก่อตั้งโรงเรียนสาธิตมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ เพื่อให้บริการแก่คณาจารย์ของมหาวิทยาลัย และให้โรงเรียนสาธิตทำหน้าที่เป็นโรงเรียนฝึกการสอนของคณะศึกษาศาสตร์ จะเห็นได้ว่าท่านเป็นผู้บุกเบิกและทุ่มเทให้แก่มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ จนมีพัฒนาการต่างๆ มาจนถึงปัจจุบัน